細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)

　　一、怎樣凍存動物細(xì)胞？
 

　　一個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。細(xì)胞冷凍過程有四個(gè)要點(diǎn)：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。
 

　　1.細(xì)胞的收獲
 

　　用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細(xì)胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。
 

　　2.保護(hù)劑的使用
 

　　細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護(hù)劑在使用時(shí)先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。
 

　　3.細(xì)胞凍存的速率
 

　　細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。
 

　　4.儲存環(huán)境
 

　　細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。
 

　　二、怎樣化凍動物細(xì)胞？
 

　　1.化凍過程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。
 

　　2.如果細(xì)胞儲存在液氮液面下，使用者最好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具(至少要戴上護(hù)目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套)，防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。
 

　　3.由于大多防凍劑與細(xì)胞長時(shí)間接觸時(shí)對細(xì)胞有毒害，所以最好盡快除去細(xì)胞凍存時(shí)加入的防凍劑。
 

　　4.防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好15-20ml培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。
 

　　5.對于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。