流式細胞儀技術原理與操作指南

　　一、流式細胞儀技術原理
 

　　流式細胞儀是一種能夠分離、鑒定和計數以單細胞液體流形式穿過激光束的細胞的高科技設備。其工作原理主要基于以下幾個關鍵點：
 

　　流體動力學聚焦原理：
 

　　細胞樣本需制成單細胞懸液。
 

　　在流式細胞儀的流動室中，細胞被鞘液包圍，通過精確控制鞘液和樣本流的流速與壓力，使細胞在鞘液裹挾下呈單列依次通過檢測區域。這樣確保每個細胞能被單獨檢測，避免細胞之間的干擾。
 

　　激光激發原理：
 

　　當細胞逐個通過檢測區時，激光束照射細胞。
 

　　若細胞中的成分被熒光染料標記，就會吸收激光能量。不同熒光染料因化學結構差異，有不同激發和發射波長。特定染料與細胞內核酸結合后，在激光照射下會產生熒光。
 

　　熒光檢測原理：
 

　　被激發的熒光信號由光學系統收集，其中濾光片可篩選特定波長熒光。
 

　　光電探測器將熒光信號轉變成電信號，電信號強度與熒光強度成正比。
 

　　通過分析電信號，可獲取細胞大小(依據前向散射光，細胞越大，前向散射光越強)、內部復雜程度(依據側向散射光)以及熒光標記所代表的生物學特性(如細胞表面抗原表達、細胞內蛋白含量、DNA含量等)等信息。
 

　　二、流式細胞儀操作流程
 

　　流式細胞儀的操作流程包括樣本制備、儀器校準、樣本檢測、數據分析等步驟，具體如下：
 

　　樣本制備：
 

　　獲取細胞樣本，并根據實驗目的選合適熒光染料染色細胞。血液樣本需抗凝處理，可用EDTA抗凝管并稀釋或用密度梯度離心分離特定細胞群。組織樣本則要機械破碎或酶消化成單細胞懸液。
 

　　注意染色的溫度和時間條件，特定抗體染色需在合適溫度下孵育一定時間。
 

　　儀器校準：
 

　　在檢測前，要調節激光功率、校準光路，確保激光準確照射檢測區域。
 

　　設置光電倍增管電壓以優化熒光信號檢測范圍。
 

　　設置閾值以排除細胞碎片等干擾，根據細胞大小設前向散射光閾值，小于一定大小的顆粒信號被排除。
 

　　樣本檢測：
 

　　將制備好的樣本放于流式細胞儀樣本架，啟動程序。
 

　　細胞在流體動力學聚焦下通過檢測區，產生的熒光和散射光信號被檢測收集。檢測中可在顯示屏實時觀察信號變化。
 

　　數據分析：
 

　　檢測完成后，用專門軟件處理數據。
 

　　可根據熒光信號強度和分布對細胞分類計數，如繪制熒光強度直方圖顯示不同強度細胞比例。
 

　　也可進行雙參數或多參數分析，如用散點圖展示兩種抗原表達水平的細胞分布。
 

　　三、注意事項與維護保養
 

　　注意事項：
 

　　樣本制備時需確保細胞懸液的均勻性和分散性，避免細胞團聚或沉淀。
 

　　儀器校準需定期進行，以確保檢測結果的準確性和穩定性。
 

　　在檢測過程中，需注意觀察信號變化，及時發現并處理異常情況。
 

　　維護保養：
 

　　定期清潔流式細胞儀的流動室、激光器等部件，避免污染和堵塞。
 

　　定期檢查并更換濾光片、光電倍增管等易損件，確保儀器性能良好。
 

　　定期對儀器進行校準和驗證，確保檢測結果的準確性和可靠性。
 

　　綜上所述，流式細胞儀是一種基于流體動力學聚焦、激光激發和熒光檢測原理的高科技設備。其操作流程包括樣本制備、儀器校準、樣本檢測和數據分析等步驟。在使用過程中，需注意樣本制備的均勻性和分散性、儀器校準的準確性和穩定性以及檢測過程中的信號變化。同時，還需定期對儀器進行維護保養，以確保其性能良好和檢測結果的準確性。