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      實時熒光定量PCR系統實驗步驟

      更新日期:2016-03-24      點擊次數:2656
       實時熒光定量PCR系統實驗步驟:  
          1.設計實驗方案:例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設計  
          2.引物和探針的設計和合成  
          3.抽提RNA,測定提取的RNA的濃度  
          4.反轉錄PCR  
          5.定量PCR  
          6.數據分析  
          在進行實時熒光定量PCR系統驗的過程中,PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素,因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率zui大值1,因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的性及重復性,影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面:1,擴增子的長度;2,擴增子的GC含量;3,擴增子、引物和探針的二級結構;4,PCR反應各組分的濃度;5,RNA或者cDNA的純度。  
          進行實時熒光定量PCR系統實驗時,必須設計好引物和探針,除了能獲得高的擴增效率外,對PCR擴增的特異性、消除基因組DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進行實時熒光定量PCR系統的熒光曲線圖(反應條件和模板都相同)。
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