PCR儀，你真的選對了嗎？

　　Kary Mullis博士也許并沒有想到，他發明的PCR技術能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅要歸功于DNA聚合酶的發展，也要歸功于PCR儀的不斷升級。如今，反應效率提高，反應體積減少，使得PCR逐漸應用在更廣泛的領域。選購PCR儀，似乎并不是一件難事。然而，對于一些關鍵的參數，你真的了解它們的意義嗎?

　　快速變溫

　　現在，快速PCR已成為一種潮流。反應時間從90分鐘縮短到30分鐘，是受歡迎的，畢竟誰也不想在預約PCR儀時排隊等太久。溫度循環是所有PCR的基礎。儀器的變溫速率將決定PCR運行的整體速度。毫無疑問，變溫越快，PCR運行也越快。宣傳資料往往也會首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀運行速度更快。因此，在拿到參數表時，我們*時間會留意變溫速率，也就是升降溫速率。

　　不過，如果大家留心看，通常會發現ramp rate前面還會有一個Max，這說明制造商公布的是zui大變溫速率。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運行過程中，上述zui大性能只在極短的時間內可達到，那種掐著秒表來計算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠意的制造商還會公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate)，表示在較長的變溫范圍內溫度變化的速率。這個參數沒那么炫目，但更具參考意義，具有比較價值。

　　當然，樣品的變溫速率可沒有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水，爐子很快就達到100oC以上，但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時間。因此，只根據模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準確。Applied Biosystems在這一點上就很周道，提供了另一種參數，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個參數能反應儀器根據體積來控制樣品達到設置溫度、遵循預設的實驗方案運行的真實能力，更有效地評估PCR儀的真實性能。

　　以Applied Biosystems ProFlex? PCR系統為例，96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達到6.0oC/秒，而標示樣品的zui大變溫速率也達到4.4oC/秒(1 μl樣品體積)。配合快速PCR試劑，擴增500 bp的片段，不到半小時即可完成。它采用溫度控制算法將樣本體積及反應管的厚度考慮在內，其實際模塊溫度高于設置點，從而使滯后的樣本溫度能夠更快地達到設置點(又稱為模塊熱過沖)。算法要才可根據不同體積使樣本達到穩定的設置點溫度且無過沖及相關的負面效應。

　　溫控準確

　　對于PCR反應而言，zui重要的莫過于溫度控制的準確性。由于PCR是一個幾何級數擴增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火而言溫控顯得尤為重要。有時，退火溫度相差1oC，就能帶來迥然不同的結果。目前，市場上的大多數PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準確性在±0.2oC左右。

　　溫度控制算法的性無疑會影響溫度控制的。前面提到的模塊熱過沖，需要非常豐富的經驗，的算法才可使不同體積的樣本達到穩定的設置點溫度且無過沖及相關的負面效應。

　　對于96孔板PCR儀來說，另一個重要的參數是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴增反應板各孔的能力至關重要，在實驗設計時常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那么我們自然無法通過比較兩個不同位置的反應孔數據，而得到可靠的結論。大多數儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S，在20-72oC時，均一性≤ ±0.3oC，在95oC，均一性≤ ±0.4oC。

　　對于梯度PCR而言，溫度準確性的要求似乎更高。梯度PCR儀zui先由Eppendorf公司在1998年研發成功推向市場(Mastercycler Gradient)。通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次反應就可以篩選出的退火溫度，優化實驗，在節約成本的同時也節約了時間。

　　傳統的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個Peltier元件組成，對它們設置不同的溫度，通過熱傳導可形成溫度梯度。不過，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設置的高溫和低溫之間的熱學相互作用，無法實現真正的線性梯度。實際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優化后的真實退火溫度，尤其是在優化難以處理的試驗時。

　　Applied Biosystems在這方面就有獨到的設計，它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個獨立的加熱/冷卻模塊，由溫度控制器單獨控制。各個Peltier模塊之間用隔熱材料進行物理隔離，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾zui小化，溫度控制更加。VeriFlex技術可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致，確保優化的PCR反應條件在隨后的日常運行中也表現出一致的結果。

　　研究人員的另一個噩夢是PCR反應會蒸發。這種蒸發現象使PCR反應體系中各組分濃度升高，特別是引物濃度升高，直接導致非特異性擴增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀則采用vapo.protect技術，防止PCR反應體系的蒸發。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材，各種不同形狀的PCR耗材都能實現覆蓋。這種技術提高了結果的重復性，是小體積擴增的理想之選。Applied Biosystems則是通過熱蓋的自動調節和凹形設計確保PCR管的密封，基本上市場面上常見的PCR耗材都可以使用。當然，通常廠家會建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材，畢竟是經過廠家多重測試的，肯定也不會錯。

　　靈活更換

　　雖說PCR儀已逐漸設計成個人化的儀器，但真的是實驗室中人手一臺，顯然并不太實際。實驗室中通常有多個課題，每個人的應用也各不相同，因此PCR儀能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數人的選擇，但未來有什么樣的需求，當下并不清楚。抱著開放的心態，選擇一臺靈活的PCR儀，也許是明智的。

　　許多PCR儀都允許更換樣品模塊，包括96孔、雙48孔和384孔等。對于有些儀器，各個模塊之間是獨立的，就像多臺PCR儀一樣，可設置不同的運行程序。比如，Applied Biosystems的ProFlex PCR系統就提供3 x 32孔獨立模塊，允許同時運行3組實驗，每組*獨立，互不干擾。這種設計提高了效率，讓苦苦等待成為過去。另外，除了標準的96孔模塊，它還提供雙96孔和雙384孔模塊，滿足高通量的測序需要。此外還有雙槽式模塊可供選擇，支持QuantStudio 3D數字PCR系統使用的芯片

　　Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀也提供4個可互換的模塊，包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應管，使反應體積zui高可達125 μl。這種大的反應體積適合新一代測序或芯片的樣品制備。

　　美好體驗

　　性能要，操作可得簡單，這也是PCR儀選購時一個重要的考慮因素。畢竟，實驗室里用戶的水平參差不齊，既有經驗豐富的老手，也有剛剛入門的新手。操作直觀、輕松編程，相信是每個人的愿望。

　　幸運的是，如今的制造商在設計時都考慮到這一點，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習慣，但大多數人享受著這種隨便點點就能設置好程序的過程。之前，Veriti PCR儀作為市場上*款觸摸屏PCR儀，在推出時就受到很多客戶的歡迎。斯坦福大學的博士后Hugo Hilton曾表示：“觸摸屏顯示很直觀，讓用戶對反應過程一目了然。"隨后Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀。隨著觸摸屏技術的快速發展，越來越靈敏、能快速反應的PCR儀也隨之產生，比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp，那感覺和iPad是一樣一樣的。

　　遠程訪問也增強了用戶體驗，它讓用戶能夠通過智能手機或平板電腦，調整操作并查看初步結果。在使用ProFlex PCR系統時，你就能通過免費的My ProFlex手機客戶端，從你的辦公室、會議室、家里，甚至其他任何地方進行遠程連接，查看PCR實驗的運行情況，或查看哪個模塊可以使用。

　　隨著PCR的應用越來越廣泛，人們也希望將PCR儀帶出實驗室，帶到診所和田間。一些制造商也推出了便攜的PCR儀，如Ahram Biosystems。不過，在大多數情況下，儀器還是擺在擁擠的實驗臺上。而且，一些必要的組件是不可少的，比如加熱元件、電源等。因此，高性能的PCR儀還是占有一定的體積。不過，如今連測序儀都跟U盤一般大了，還有什么是不可能的呢。

　　過去三十年，PCR已經帶給了我們很多的驚喜。未來，儀器性能會更高，操作會更簡便，功能會更多樣，只是，選擇會更困難。擦亮雙眼，看看你真的需要什么，再做決定吧。